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上海跃进医疗器械有限公司厌氧培养箱法对新疆驴盲肠中纤维素分解菌的初步分离与鉴定

[导读]厌氧培养箱是一种在无氧环境条件下完成细菌培养的专用装置。试验以上海跃进医疗器械有限公司的YQX-II型厌氧培养箱完成,该法与分子生物学上常用于细菌鉴定的16S RNA法(免培养)相比较,又称为可培养法。

为探寻新疆驴盲肠中的优势纤维素分解菌,笔者以可培养法对驴盲肠中菌群进行富集培养、分离纯化、刚果红识别(初筛)、形态学观察、滤纸酶活力测定、复筛以及生化鉴定得到1株酶活性较高的菌株;根据与《伯杰细菌系统鉴定手册》和《细菌编码鉴定表》比对,确定该菌株是编码为AG632的埃希大肠杆菌。

新疆驴是一个优良的地方品种,耐粗饲,其对粗纤维的摄取、消化和降解能力较强[1,2]。盲肠是驴进行纤维素分解的主要场所,该处肠道微生物多以厌氧菌为主。因此,试验采用厌氧培养箱法对新疆驴盲肠中纤维素分解菌的种属、类别进行相关研究,旨在确定优势纤维素分解菌。本研究最初的目的是为了从以粗纤维为饲料的新疆驴盲肠内容物中分离出厌氧纤维素降解菌,但在分离的菌株中发现一株兼性厌氧的埃希大肠杆菌对纤维素也具有较好的降解能力,故作以报道。

1 材料

1.1 样本采集

新疆驴盲肠液采自新疆阿克苏某定点屠宰厂,无菌采样后-80℃保存,待测。

1.2 培养基的制备

1.2.1 分离培养基[羧甲基纤维素钠(CMC-Na)培养基]

氯化钠6 g、7水硫酸镁0.1 g、磷酸二氢钾0.5 g、氯化钙0.1 g、磷酸氢二钾2.0 g、酵母膏1.0 g、硫酸二胺2.0 g、2%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10.0 g、2%琼脂(加刚果红0.01 g)10.0 g,纯化水定容至1 000 m L,调p H值至7.0~7.4,121℃高压灭菌30 min。

1.2.2 富集培养基

磷酸二氢铵0.5 g、磷酸二氢钾2.0 g、硫酸镁2.0 g、1水硫酸锰2.5 mg、7水硫酸亚铁7.5 mg、氯化钠0.3 g、羧甲基纤维素钠5.0 g,纯化水定容至1 000 m L,调p H值至7.0~7.4,121℃高压灭菌30 min。

1.2.3 复筛培养基(液体培养基)

磷酸氢二钾2.0 g、磷酸二氢钾0.5 g、氯化钠6 g、7水硫酸镁0.1 g、氯化钙0.1 g、酵母膏1.0 g、硫酸铵2.0 g、琼脂20 g,纯化水定容至1 000 m L,调p H值至7.0~7.4,121℃高压灭菌30 min。

1.3 主要试剂

生化鉴定管(杭州天和微生物有限公司);乙醇溶液、碘液、沙黄、结晶紫及刚果红等均为国产分析纯产品。

1.4 主要仪器

高压灭菌锅(SANYO,MLS-3750型)、厌氧培养箱(上海跃进,YQX-11型)、光学显微镜(江苏康健有限公司)、洁净工作台(上海精宏,SW-CJ-2F型)、电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒,DHG-9140A型)。

2 方法

2.1 厌氧培养箱法

厌氧培养箱是一种在无氧环境条件下完成细菌培养的专用装置。试验以上海跃进医用光学器材厂的YQX-11型厌氧培养箱完成,该法与分子生物学上常用于细菌鉴定的16S RNA法(免培养)相比较,又称为可培养法。

2.2 菌株初筛

将无菌采取的盲肠液置于含无菌水和玻璃珠的三角瓶中,充分振荡溶解后取上清液以CMC-Na培养基置于厌氧培养箱中培养2~3 d(初筛)后观察菌落形态特征(颜色、形状、质地等);经革兰染色后在显微镜下观察并记录菌体形态特征,并将疑似优势菌株作为后续试验菌株。

2.3 菌株复筛

将经镜检初筛出的优势菌株接种到5个装有滤纸片(已称重)的液体培养基中,37℃静置培养48 h后观察培养基上滤纸的形态变化及菌株的生长状况,并称量滤纸质量,记录结果。

2.4 菌株纯化

将经复筛得到的单菌落接种于CMC-Na培养基上,置于厌氧培养箱内37℃恒温培养48 h。待平板上长出菌落后,立即挑取,并在CMC-Na平板上划线分离培养以得到单一菌落。

2.5 菌株生化鉴定

将经初筛、复筛、分离、纯化得到的优势菌株,以鉴定管法进行生化鉴定,即采用细菌编码鉴定检索方法。本试验中,常规生化反应10项,将分离纯化得到的单一菌落接种到鉴定管内,37℃培养48 h后观察鉴定管变化,并记录结果。


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