目的 比较细胞工厂培养箱及普通培养箱用于生产水痘疫苗的差异。方法 对两种培养箱进行温度测试。比较两种培养箱内培养人胚肺成纤维MRC-5细胞的生长情况及活细胞数量,并对制备出的相应水痘疫苗原液进行无菌检查及病毒滴度测定。结果 与普通培养箱比较,细胞工厂培养箱的温度更稳定;培养MRC-5细胞的贴壁范围更大,活细胞数更高,且批内及批间的均一性更好;其制备水痘疫苗原液的病毒滴度略高,批内及批间的均一性更好,且无菌检查均合格。结论 应用细胞工厂培养箱制备水痘疫苗,可提高疫苗的批间均一性,降低人工劳动强度及污染风险,适用于大规模疫苗生产。

水痘是由水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)引起的急性呼吸道传染病,具有高度传染性,常见于儿童,发热伴全身瘙痒性皮疹、斑疹、丘疹和水泡疹是其主要临床特征[1]。自1974年Oka株水痘减毒活疫苗(varicella attenuated live vaccine,Var V)问世以来,已在许多国家开展接种,并取得了明显的保护效果[2,3,4,5,6]。

目前,在我国水痘疫苗生产中,工艺培养物的培养多采用普通培养箱(实验室常见),该方法虽然通过使用多台普通培养箱也能满足现有工艺,但仍存在容纳细胞工厂的能力有限,劳动强度较高的问题。进行规模化生产[7,8,9,10,11]后,该问题更为突出。应用细胞工厂培养箱,每台容纳能力大幅提升,减少了操作频次,降低了人工成本和劳动强度。因此,为了配合大规模制备水痘疫苗,本实验采用细胞工厂培养箱来培养工艺培养物,以期达到提高疫苗批间均一性,降低人工劳动强度的目的[12,13,14,15]。

1 材料与方法

1.1 细胞株

人胚肺成纤维MRC-5细胞购自ATCC;Oka株VZV毒种由日本大阪大学微生物病研究会提供。

1.2 主要试剂及仪器

MEM和胰蛋白酶购自美国Gibco公司;氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠购自国药集团化学试剂公司;新生牛血清购自上海慧人生物科技工程研究所;其他试剂均为市售分析纯;10和40层细胞工厂、普通培养箱、细胞工厂培养箱、细胞工厂振动器购自美国Thermofisher公司;多层培养器显微镜购自日本四国株式会社;Roux瓶购自上海玻璃仪器厂。

1.3 温度分布测试

使用校准好的测试探头进行温度测试,测试点为多点均匀分布,保温72 h。在培养箱达到稳定状态后,开始进行温度监控。

1.4 细胞培养

将24代MRC-5细胞复苏后,于37℃静置培养3~5 d,按照1∶2的比例进行传代扩增至细胞工厂,分别于普通培养箱(10层细胞工厂)及细胞工厂(40层细胞工厂培养箱)内进行静置培养,共培养3批(普通培养箱:S2014021、S2014022、S2014023,细胞工厂培养箱:S2014024、S2014025、S2014026),连续传代至第32代时观察细胞生长情况,并于对数生长期时进行活细胞计数。试验重复3次,计算批内及批间的变异系数(CV)。

1.5 水痘疫苗原液的收获

细胞连续传代至第32代,按感染复数(Multiplicity of Infection,MOI)=0.001~0.01接种32代水痘Oka株工作毒种,于37℃静置培养2~3 d;收获感染的细胞,每层细胞工厂加入10 ml蔗糖磷酸缓冲溶液PBS,制备水痘疫苗原液。按经国家食品药品监督管理局批准的水痘减毒活疫苗注册标准[16]对两种方式制备的水痘疫苗原液进行无菌检查及病毒滴度测定,试验重复3次。

2 结果

2.1 温度分布

测试结果表明,普通培养箱的测试点温度波动范围为36.3~37.8℃,较细胞工厂培养箱测得的范围(36.8~37.3℃)略宽,见图1。表明细胞工厂培养箱可提供更稳定的温度环境,更符合工艺培养的要求,适宜工艺培养物的生长。

2.2 MRC-5细胞生长情况的比较

经两种培养箱培养的MRC-5细胞贴壁速度均较快,呈梭状,胞质饱满。但普通培养箱内培养MRC-5细胞的MEM溶液颜色偏红,细胞贴壁略不均匀;细胞工厂培养箱内培养的MRC-5细胞贴壁范围更大,见图2。MRC-5细胞进入对数生长期后,细胞工厂培养箱中培养的活细胞计数为1.0×107个/ml,较普通培养箱(0.9×107个/ml)略高,细胞生长略快。细胞工厂培养箱及普通培养箱批内CV分别为2.06%和6.52%,批间CV分别为3.94%和7.81%,见表1。表明细胞工厂培养箱培养MRC-5细胞的均一性较好。